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松杉靈芝免疫調節蛋白的構造與作用機制之研究
 
指導教授:林榮耀 教授
研究生:林文輝
 
【摘 要】
靈芝自古為我國吉祥如意的象徵,歷代都有關於靈芝的傳說與記載,醫藥學家認為靈芝能治療多種疾病,是滋補強壯,扶正固本的珍貴藥材,至於其真正的作用機制仍然不很清楚。
 
 本實驗室從松杉靈芝(G.tsugae)之菌絲體純化出一種免疫調節蛋白質、命名為FIP-gts(fungal immunomodulatory protein gts)、分子量約為 13 K,其可促進人類末梢淋巴球 (human peripheral lymphocytes)細胞,以及小白鼠脾臟細胞之增生,在濃度為5μg/ml時,對人類周邊淋巴球細胞可達到最高之增殖作用。在細胞激素(cytokines)方面,經由RT-PCR証實,可促進IL-2,IL-4、TNF-、及IFN-等產生,也可以促進ICAM-l(intracellular adhesion molecule-l)之表現。
 
 FIP-gts 經蛋白水解酵素水解後,利用自動胺基酸分析儀(automatic protein sequencer),分析其胺基酸序列,可知含有110個胺基酸,其序列與免疫球蛋白質重鏈(variabl region of immunoglobulin heavy chain,IgVH)有很高的相似性。經由Garnier方法分析其二級結構,可知具有二個-helices及七個 -sheets及一個-turn之構造。利用膠體過濾管柱(gel filtration)分析,求得分子量為 26 K,但是以SDS-PAGE分析則為13K,顯示FIP-gts 可能以homodimer形式存在,此點可由處理glutaraldehyde証實FIP-gts 可形成homodimer。利用鏈聚合脢連鎖反應(PCR)技術,除了在松杉靈芝外,我們也在多種不同靈芝中發現有相同之核酸序列,但是並不是所有真菌類都存有此免疫增強蛋白質。
 
 我們利用遺傳工程方法將FIP-gts之cDNA嵌入PGEX-2T 質體,並置於大腸桿茵中表現,利用Glutathione-Sepharose 4B親和性管柱,可純化出含 GST和重組FIP-gts 的融合蛋白質(fusion protein),經由出thrombin分解後,可得到純化的FIP-gts 蛋白質,其刺激人類淋巴球細胞增殖活性與由菌絲體純化之FIP-gts相同。
 
 此外,為了探討FIP-gts 的化學結構與生理活性之關係,故設計多種不同primers,可構築出不同之刪除(deletion)突變蛋白質,其分別為﹕△N1-3(刪除第一到三個胺基酸)、△N1-6、△N1-13、△N1-27、△N106-110、△N101-110、△N1-13/△N101-110及△N1-27/△N101-110等,藉由定點突變(site–directed mutagenesis)技術,以及根據helical wheel program 預測,可證實FIP-gts之氮端十三個胺基酸會形成-helix A,若將其刪除則 hydrophobic moment由野生株(wild type)之0.43降為0,並且喪失生理活性,同時也不再形戌homodimer,而是以monomer形式存在。若同時去除氮端第五個 leucine;第七個 phenylalanine ;第九個 leucine (△5L/7F/9L),其 hydrophobic moment則降為0.1,除了會失去-helix A 結構外,同時也失去生理活性。故我們可証實FIP-gts 主要生理功能是靠氮端之-helix A 形成homodimer,藉由結合到淋巴球T細胞上而產生一連串之訊息傳遞,並促進分泌各種細胞激素來達成免疫調節之功能。